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日期:2022-09-25 03:59
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摘要:实时荧光定量PCR样品RNA的抽提

实时荧光定量PCR样品RNA的抽提:

1.  取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。


2.  两相分离 每1 ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2 ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12 000 rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。


3.  RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12 000 rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。


4.  RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7 000 rpm离心5分钟。


5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。


6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水4 0ul用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

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